“恐伤肾”的基因心理学和中医心理学研究

           王米渠1 王刚2 薛嘉莲3 陈兰英4 袁世宏5 冯韧1 李炜弘1 谭从娥1 高泓1 陈康1 严石林1

1．成都中医药大学2．四川大学3. 香港城市大学

4．江西中医学院5．山西职工医学院

    惊恐是哺乳动物的基本情绪，压力恐惧是当今心身疾病的重要的发病因素，“恐伤肾”应激是中医心理学的认识，补肾药调治这方面的疾病中药有独到的疗效。以此为突破口，我们在国家自然科学基金的三次资助中，从恐惧的整体行为、生理、症状等，到细胞水平的免疫，病理，生化等，再深入于分子水平的个别基因、基因表达谱等方面研究积累，已将“恐伤肾”应激研究推向情绪心理学、心身医学、基因心理学和中医心理学的研究前沿，本文主要报道三种层次的实验和两种分子生物学方法对惊恐基因的研究，尤其是抑制削减杂交(Suppression subtractive hybridization，SSH)的方法新发现“恐伤肾”应激的10个与惊恐相关的基因，及其中医药调治的分子机理。

一、“恐伤肾”应激的整体行为和细胞水平的研究

    (一)猫吓鼠制造“恐伤肾”应激模型

      猫吓孕鼠制造“恐伤肾”应激动物摸型，用昆明系小白鼠108只，其中雌鼠71只，雄鼠37只，按雌：雄=2：1的比例交配后，将雌鼠随机分为3组。对其中的恐吓组和反证组用雄性善叫、善捕鼠的家猫极度地恐吓(鼠笼直接处于猫笼下，中间仅隔一层铁丝网，猫有时可触及到鼠)，每天上午9-10点，下午3-5点各恐吓2小时，共14天。反证组在恐吓的同期，以饲料中拌以中药金匮肾气丸饲养，按小鼠的体重以成人体重比例10倍的给予。另外，对照组既不恐吓，也不用药。．

    (二)恐惧应激的行为测试及常异表现

      对恐吓组、对照组、反证组的亲代鼠及其下一代子鼠，我们作了28种行为和遗传行为测试，多见到经统计学处理的显著差异，说明极端的恐惧应激对哺乳动物有严重的、长久的行为常异表现。行为测试主要有：空地测试、爬杆测试、悬挂尾测试、走钢丝测试，下滑绳测试、巷道趋食测试、高立钢管测试，亮盒排便测试，跳台测试等方法。以常用的空地(旷场)测试为例，对照组18只鼠在90秒中爬行木板上的方格(15cm×l5cm)数平均为12.2土11.3，而恐吓组则惊慌不安，恐惧不已，情绪不稳，表现其空地爬行格数异常增加—倍多，为30.1土15.1。同样这两组各18只鼠在60秒内爬杆(长250cm、直径1cm，上面每l0cm刻度)测试，对照组与恐吓组爬行距离平均数为214.9土160.0与308.4土179.2，这两项行为测试P<0.01。

    (三)免疫生化等细胞水平的研究结果

     对上述猫吓孕鼠“恐伤肾”的恐吓组、反证组母代及于代初生鼠，及无恐吓的对照组备制生化测试标本。对其初生鼠出生的当天处死2／3，处死后立即剥取脏器，将脑、胸腺等组织放人-20℃冰箱陆续取出作生化测试。免疫测试则在处死前尾部取1滴血，作红细胞C3b受体花环(Red Blood cell-C3b Rosette，RBC-C3bRR)及红细胞免疫复合物花环(Red Blood Cell-Imune Complex Rosette，RBC-ICR)的检测。鼠处死后，取出脾脏作自然杀伤细胞活性(Natrect Kill Cell Activity，NKCA)及白细胞介素-2(Intereukin-2 Activity，IL-2)检测，采用4-甲基偶氮唑盐(MTT)改良法。另外将荷瘤小鼠S180腹水瘤细胞悬浮液转种于产子后95日龄母鼠腹腔内繁殖，作直向肿瘤红细胞花环(Direct Tumour Erythrocyte Rosette，DTER)，促瘤红细胞花环(Enhance Tumour ErythrocyteRosette，TTER)及协同肿瘤红细胞花环(Associate Tumour Erythocyte Rosette，ATER)，检测三种肿瘤红细胞花环率。实验结果均见惊恐应激对生化、免疫的不良影响。

二、“恐伤肾”应激的c-fos即早基因表达的改变的研究

    (一)猫声并叩击大鼠制造“恐伤肾”应激模型

     将30只SD雄性大鼠随机分为正常对照组，造模恐吓组和药物反证组等3个组，各组10只动物，后两组放送有凶狠猫叫声的磁带，同时用梅花针叩击大鼠(20次／min)，模拟猫抓拿攻击大鼠的情景，每次10分钟，连续进行10天。反证组每天灌胃中药肾气丸2m1／每只。取材前一天全部大鼠禁食12小时，将恐吓组、反证组最后一次惊恐刺激，然后静置30分钟，三个组同时处死取材。在戊巴比妥钠(60mg／kg，ip)深麻醉下，经升主动脉快速灌注37℃生理盐水250ml冲洗，4%多聚甲醛300ml灌注，持续1.5小时，断头取材，再作切片，用FOS蛋白免疫组化测定法测试。

    (二)c-fos即早基因表达结果及分析

     c-fos基因是即早基因表达基因中特别敏感的，常用的，从下表可知，恐吓造模组与正常对照组比较，大鼠丘脑和海马c-fos基因表达明显增高(P<0.05)，而药物反证组与正常对照组比较接近，无明显变化(P<0.05)。反证组用补肾药物后与恐吓组比较海马和丘脑的c--fos基因表达却受到一定的抑制，而有降低的趋势(P<0.05)。显示中医“恐伤肾”应激及补肾药调治这方面的疾病中药有独到的疗效。

表1 大鼠FOS样阳性免疫反应光密度测定结果

注：*与空白对照组比较P<0.05

    (三)应激肾虚的分子生物学认识深入的初阶

     从进化遗传学角度观察，模仿自然界中鼠与猫的天敌关系，制造惊恐的典型动物模型，来研究惊恐的分子遗传学机理更具有优越性。尽管c-fos即早基因表达还不是惊恐的特异基因，但其关系被实验所证实对深入研究哺乳动物的惊恐基因及其系统进化中仍有意义。从行为、症状角度分析，极端恐惧应激下的异常表现，在大鼠的丘脑、海马部位的c-fos表达明显增加，与目前“肾”的藏象理论，定位于下丘脑，与神经内分泌免疫网络系统有广泛的相关。这利于我们前期对恐惧应激的一系列行为、症状、病理、免疫、生化等实验结果的进—步深入分子机理研究。在本实验进行即早基因表达的中药反证组，开始探讨补“肾”药物治疗的分子生物学依据，在调整机体应激后的阴阳平衡，调控c-fos基因的适当表达，能避免神经元的异常死亡。这些都展示着进—步全面开展应激的分子生物学研究的良好前景。

三、“恐伤肾”应激新发现10个差异表达基因谱

    (一)猫吓鼠结合反吊荡水制造“恐伤肾”应激模型

     实验改良设计“恐伤肾”应激，以获得典型的动物模型，结合使用猫叫、鼠的自然历程与反吊荡水的稳定刺激两种方法优点。实验动物分组为造模恐怖的恐吓组，恐吓应激同期服用金匮肾气丸的反证组，非恐吓非补药而自然生长的对照组。每组各随机取雄性成年鼠(50~60天龄，BALB＼c近交系一级)六只，对恐吓组、反证组小鼠每天上午以成年而较凶狠的家猫—只，猫笼置于鼠笼上，猫可探爪略触及小鼠，恐吓小鼠2小时，届时喂食小鼠一只，以强化恐惧情绪；每天下午则将鼠尾悬吊在水槽上，迫使其处于抬头和四肢不断活动状态，时晃荡水槽，强化刺激，持续14天，造模“恐伤肾”应激肾虚的动物模型。反证组在恐吓的14天同期以金匮肾气丸(成人体重比例的10倍)灌胃。

    (二)抑制消减杂交筛选恐吓应激的10个差异表达基因

     对建模前、后的动物，分别眼底采血，提取总RNA，用SMART技术(Clontech)逆转录扩增总cDNA。再应用抑制消减杂交法(SSH)筛选差异表达基因，选择性的扩增目标cDNA片段，同时抑制非目标片段扩增。进而取得了惊恐应激致肾阳虚的10个差异基因图谱。图谱中每—横排为—个基因，补肾治疗组居中，其亮度都接近于对照组，优于恐吓组。在这10个差异基因图谱中，回收测序的有如：β血红蛋白基因、α血红蛋白基因的mRNA、线粒体基因组三种tRNA等5个基因表达谱。用SSH发现的这些与惊恐应激有关的功能基因，异于目前报导较为集中的基因，如激活下丘脑的转录因子AP-1而促进POMC基因表达，诱导肾上腺皮质hsp70的表达，情绪应激提高催乳素受体基因的表，恐惧能降低神经元中过量表达的bcl-2基因，IL-2受体基因表达的调节等惊恐应激基因等。“恐伤肾”发现的基因，为深入研究恐惧应激提出了新的问题；也可望对中医肾阳虚证复杂分子机理研究上，提升—个多基因的新台阶。

    (三)新技术为中医心理学等复杂问题提供了—种有力的方法

     抑制消减杂交(SSH)自1996年报道以来，该技术克隆了多种新基因。尤其脑缺血耐受相关基因(编码TIMP-1)、肾细胞癌相关基因等，这方面以SSH的建立者Diatchopnko所在的CLONTECH实验室和斯坦福大学RONALD JWeigel研究小组的工作最为出色，目前渐为分子生物学研究者广泛应用。SSH方法对于研究恐惧、压力、记忆、行为、症状、疾病、复方、中药，针灸、智能、长寿等这类大量未知的基因表达问题特别有用。如本实验“恐伤肾”应激可以从行为等整体水到细胞水平、基因水平都可见一系整合全面的表现，决不止仅是一、二个，而是一组、一批、—群、甚至一大类基因，以前研究较早采用c-fos等即早基因，生长刺激因子等RT—PCR方法，对有限的已知基因功能，最多可以作为分子生物学起步研究，以前的方法对恐吓、应激、肾虚、温补等复杂现象研究用单一作用途径的方法来说是远远不够，因为传统方法没有能够多基因同时考察研究。若采用抑制消减杂交去筛选其表达差异基因和评价补肾药的分子疗效，尤其是SSH结合基因芯片(DNAMicroarray)方法去研究恐吓应激，这可能是目前最佳组合的分子生物学的前沿研究方法。